John Malkovich apai ágról horvát származású. Apai nagyszülei az Osztrák–Magyar Monarchia idején vándoroltak Ozalyból az Egyesült Államokba. Édesanyja skót, angol, francia és német illetőségű családból ered. Malkovich az illinoisi Christopherben született 1953-ban, és a közeli Bentonban nőtt fel egy a South Main Streeten található, nagy családi házban. Apja Daniel Malkovich természetvédelmi szakember, anyja Joe Ann, két helyi újság kiadója volt. Malkovich a Benton High School gimnáziumban töltött évei alatt már játszott különböző darabokban. Az iskolában tagja volt egy folk/rock triónak, egy 1972-es helyi nyári színházi projekt keretében pedig az egyik főszereplője lett Jean-Claude Van Itallie Hurrá, Amerika című darabjának. Egyetemi tanulmányait a Kelet-Illinoisi Egyetemen kezdte, majd az Illinoisi Állami Egyetemen fejezte be, színház szakon, bár diplomáját csak 2005-ben kapta kézhez – utolsó vizsgájáról ugyanis, mivel a teremben „meleg volt és büdös”,[1] inkább kisétált. 1976-ban Gary Sinise, Glenne Headly és Joan Allen társaságában a chicagói Steppenwolf színházi társulat tagja lett. 1980-tól a Steppenwolf New York-i darabjaiban szerepelt, Sam Shepard True West című darabjában nyújtott alakításáért elnyerte az Obie-díjat. 1984-ben Lanford Wilson Balm in Gilead című darabjában betöltött szerepéért újabb Obie-díjat, valamint Drama Desk-díjat kapott. 1984-ben debütált a Broadwayn, Arthur Miller Az ügynök halála című drámájában Dustin Hoffman oldalán játszotta Biffet; a darab televíziós változatában nyújtott teljesítményéért 1985-ben Emmy-díjat kapott.
Malkovich a 90-es évek elején sorra kapta a főszerepeket: Oltalmazó ég (1990), Régi idők (1991), Fedezetlen szerelem (1991), Jennifer 8 (1992). Az 1992-es John Steinbeck-adaptációban, az Egerek és emberekben Lennie-t alakította Gary Sinise oldalán. 1993-ban Clint Eastwooddal volt látható a Célkeresztben (1993) című thrillerben. Malkovich olyan nagyszerűen formálta meg a politikai merénylőt, hogy 1994-ben BAFTA-díjra, Golden Globe-díjra, sőt Oscar-díjra is jelölték. Malkovich több vészjósló figurát alakított: 1994-ben Kurtz ezredesként játszott a Joseph Conrad A sötétség mélyén című regényéből készült azonos című TV-filmben, és Mr. Henry Jekyllként, illetve Mr. Edward Hydeként kettős szerepet alakított A gonosz csábításában (1996); alattomos férjet játszott az Egy hölgy arcképében. Együtt játszott Nicolas Cage-el a Con Air – A fegyencjárat (1997) című filmben, azért vállalta el az elvetemült bűnöző, Cyrus „a Vírus” Grissom szerepét, mert annyi pénzt kapott érte, mint öt filmjéért együtt. Ezután A vasálarcosban (1998) olyan nagyszerű színészekkel játszott, mint Leonardo DiCaprio, Jeremy Irons, Gabriel Byrne és Gérard Depardieu, majd Edward Nortonnal és Matt Damonnal szerepelt együtt a Pókerarcokban. 1999-ben Az Aranypolgár születésében nyújtott alakításáért megkapta második Primetime Emmy-díj jelölését. Még ugyanebben az évben játszotta kétségkívül legszokatlanabb szerepét: Spike Jonze szürreális mozijában, a John Malkovich menetben (1999) önmagát kellett alakítania, amint saját elméjébe tudta nélkül hívatlan vendégek telepednek be. A film szinte egyöntetű elismerést aratott, Malkovich pedig a legjobb férfi mellékszereplő kategóriájában megkapta a New York-i Filmkritikusok Egyesületének díját.

2000 után
Malkovich A John Malkovich menet után F.W. Murnau rendezőt alakította A vámpír árnyéka (2000) című horrorban. E. Elias Mehrige filmje Murnau legendás 1922-es klasszikusának a Nosferatu elkészítésének folyamatát mutatja be. A filmben Malkovich remekelt, de alakítása mégis elmaradt Willem Dafoe játéka mellett, akit Oscar-díjra jelöltek. Szerepel A nyomorultakban (2000), majd Vin Diesellel áll szemben a Keménykötésűekben (2001). 2002-ben Matt Damon oldalán a A tehetséges Mr. Ripley folytatását A Ripley és a maffiózókat (2002) vállalta el, ezzel egy időben pedig Charles Talleyrand-t alakította Christian Clavier és Gérard Depardieu mellett a Napóleon című történelmi kalanddrámában. Fáradozásáért megkapta a harmadik Emmy-díj jelölését. Első rendezése a Táncos a házban című politikai dráma volt, a főszerepre Javier Bardemmet kérte fel. Játszott a Johnny Englishben (2003), majd még ebben az évben Stanley Kubrick csaló szerepében tűnt fel a Kubrick menetben. A Galaxis útikalauz stopposoknak (2005) című kasszasiker révén ismét sikerfilmben szerepelhetett, majd folytatta a gyatrább mozikat: Ízlésficam (2006), Klimt (2006), In Tranzit (2007) és Eragon (2005). 2008-ban ismét nagy mozikban szerepelhetett, a Coen-fivérek Égető bizonyítékában mint CIA-ügynök és az Elcserélt életekben mint Gustav Briegleb tiszteletes. Legújabb filmje a Transformers harmadik része, valamint készülőben lévő mozijai az As Linhas de Torres, melyben főszereplő a Warm Bodies című romantikus-horrorban is szerepet kapott.